β-νικοτιναμιδίου (NMN) σε Escherichia coli

Αφηρημένη

Ο διαβήτης είναι μια χρόνια και προοδευτική ασθένεια με συνεχώς αυξανόμενο επιπολασμό, αυξάνοντας την οικονομική πίεση στα παγκόσμια συστήματα υγειονομικής περίθαλψης. Πρόσφατα, η αντίσταση στην ινσουλίνη, σφραγίδα του διαβήτη τύπου 2, σκληρύνθηκε σε ποντίκια που έλαβαν ΝΟΝ ⁺ πρόδρομο β-νικοτιναμίδιο μονοπύρηνο (NMN) , δεν αναφέρθηκαν τοξικά αποτελέσματα. Ωστόσο, το NMN έχει υψηλή τιμή, απαιτούνται πιο αποδοτικές μέθοδοι παραγωγής. Η μελέτη αυτή προτείνει μια βιοτεχνολογική μέθοδο παραγωγής NMN στο Escherichia coli . Δείχνουμε ότι η δισιστρονική έκφραση της συνθετάσης ανασυνδυασμένης νικοτιναμίδης φωσφοριβοζυλ τρανσφεράσης (Nampt) και πυροφωσφορικής φωσφοριβοζυλίου (PRPP) παρουσία νικοτιναμιδίου (NAM) και λακτόζης μπορεί να είναι μια επιτυχημένη στρατηγική για οικονομικά αποδοτική παραγωγή ΝΜΝ. Οι φορείς έκφρασης πρωτεΐνης που φέρουν γονίδιο NAMPT από Haemophilus ducreyi και PRPP συνθετάση από Bacillus amyloliquefaciens με μετάλλαξη L135I μετασχηματίστηκαν σε Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS. Η παραγωγή NMN έφθασε τα μέγιστα 15,42 mg ανά Ι_ βακτηριακής καλλιέργειας (ή 17,26 mg ανά γραμμάριο πρωτεΐνης) σε αυτά τα κύτταρα που αναπτύχθηκαν σε μέσο ΡΥΑ8 συμπληρωμένο με 0,1% ΝΑΜ και 1% λακτόζη.

Εισαγωγή

Σύμφωνα με τη Διεθνή Ομοσπονδία Διαβήτη, ο αριθμός των ενηλίκων με διαβήτη τύπου 2 ήταν 425 εκατομμύρια το 2017 και αναμένεται να φτάσει τα 649 εκατομμύρια μέχρι το 2045. Σε παγκόσμια κλίμακα, το 12% του προϋπολογισμού για την υγειονομική περίθαλψη (ή 727 δισεκατομμύρια δολάρια) για τη θεραπεία του διαβήτη. Πρόσφατες μελέτες συνέδεσαν την αντίσταση στην ινσουλίνη, το χαρακτηριστικό γνώρισμα του διαβήτη τύπου 2, στην πτώση της μιτοχονδριακής λειτουργίας και των μειωμένων επιπέδων NAD ⁺ , καθώς και της αναλογίας NAD ⁺ / NADH, που παρατηρήθηκε επίσης στη γήρανση. Το NAD ⁺ είναι παρόν σε όλους τους ζωντανούς οργανισμούς και είναι ένα πολύ γνωστό συνένζυμο σε αντιδράσεις οξείδωσης-μείωσης. Οι ΝΑΟ ⁺ εξαρτώμενες αποακετυλάσες πρωτεΐνης όπως οι SIRT1 και SIRT6 χρησιμεύουν ως μεταβολικοί αισθητήρες και ρυθμίζουν τις κατάντη οδούς, οι οποίες τελικά αποκαθιστούν τη λειτουργία των μιτοχονδρίων και την ευαισθησία στην ινσουλίνη. Το εύρημα αυτό επεκτείνει τον ερευνητικό τομέα των επιδράσεων του NAD ⁺ σε άλλες εκφυλιστικές ασθένειες που σχετίζονται με τη γήρανση, όπως: καρδιαγγειακή, καρκίνος, αρθρίτιδα, οστεοπόρωση ή ασθένειες Alzheimer.

Το νουκλεϊνίδιο β-νικοτιναμιδίου (NMN) είναι ένα ενδιάμεσο προϊόν της NAD ⁺ βιοσύνθεσης που παράγεται από το νικοτιναμίδιο (NAM) και το πυροφωσφορικό φωσφοριβοζύλιο (PRPP) από ένζυμο νικοτιναμίδης φωσφοριβοζυλ τρανσφεράσης (Nampt) (EC 2.4.2.12). Είναι καλά ανεκτό, χωρίς ανεπιθύμητες παρενέργειες κατά τη διάρκεια μακροχρόνιας χορήγησης σε ποντικούς και με την πρόληψη της φυσιολογικής πτώσης που σχετίζεται με τη γήρανση, το NMN αποδείχθηκε αποτελεσματικό στη θεραπεία του διαβήτη τύπου 2 που προκαλείται από τη διατροφή με υψηλή περιεκτικότητα σε λιπαρά, αντιστρέφοντας τη μιτοχονδριακή δυσλειτουργία που σχετίζεται με τη γήρανση και τη διάσωση την επίδραση της συρροής που σχετίζεται με την ηλικία στα νευρικά βλαστοκύτταρα.

Το NAM μετατρέπεται συνήθως σε NMN από ένζυμα που εμπλέκονται στις οδούς διάσωσης NAD ⁺ , όπως το Nampt. Η δράση αυτού του ενζύμου αποτελεί την κύρια αναβολική δραστηριότητα NAD ⁺ στο κύτταρο. Η ρύθμιση του μεταβολισμού και της βιοσύνθεσης των νουκλεοτιδίων των θηλαστικών ή των μικροοργανισμών συνήθως προχωρά με την κατανάλωση PRPP. Το PRPP προκύπτει από ριβόζη-5-φωσφορικό μέσω οξειδωτικών και μη οξειδωτικών κλάδων οδού φωσφορικής πεντόζης.

Στα βακτήρια, το NAM μετατρέπεται πιο συχνά σε νικοτινικό οξύ (ΝΑ) από τη νικοτιναμιδάση, η οποία είναι ενσωματωμένη στην οδό Preiss-Handler, και αυτή είναι και η περίπτωση του Escherichia col . Στα θηλαστικά, η δραστηριότητα της νικοτιναμιδάσης δεν αναφέρθηκε. Το ΝΑΜ μετατρέπεται σε ΝΜΝ από ένα από τα ένζυμα φωσφοριβοσυλοτρανσφεράσης ΝΑΜ αντ 'αυτού. Αν και τα περισσότερα βακτήρια έχουν έλλειψη ΝΑΜ φωσφοριβοσυλοτρανσφεράσης, το ένζυμο εκφράζεται σε Haemophilus ducreyi και Shewanella oneidensis .

Απλοί και μεταβολικά πολυδύναμοι οργανισμοί, όπως Escherichia coli , χρησιμοποιούνται συχνά στη βιοτεχνολογία για ελεγχόμενη έκφραση πρωτεϊνών με επιθυμητή ενζυμική δραστικότητα. Το DNA που κωδικοποιεί για τέτοια ένζυμα εισάγεται συχνά σε βακτήρια από φορείς έκφρασης όπως το σύστημα pET από την Novagen. Οι φορείς ρΕΤ μετασχηματίζονται σε βακτήρια που εκφράζουν Τ7 RNA πολυμεράση, όπως το Ε . coli BL21 (ϋΕ3). Ο έλεγχος της έκφρασης των ενζύμων επιτυγχάνεται χρησιμοποιώντας προαγωγό lac , ο οποίος μετατρέπει την έκφραση μόνο παρουσία λακτόζης (που επίσης μεταβολίζεται ως πηγή άνθρακα) ή του συνθετικού δομικού αναλόγου της, ισοπροπυλο-1-θειο-β-D-γαλακτοπυρανοσίδης (IPTG) δεν μεταβολίζεται, με σταθερή συγκέντρωση κατά τη διαδικασία ανάπτυξης). Καθώς ο βακτηριακός μεταβολισμός είναι ευπροσάρμοστο, η διαφοροποίηση της πηγής άνθρακα και η συγκέντρωση των ενζυμικών υποστρωμάτων που συμπληρώνονται με μέσο είναι σημαντικοί παράγοντες που πρέπει να ληφθούν υπόψη σε μια βιοτεχνολογική διαδικασία.

Προκειμένου να αντιμετωπιστεί το τρέχον πρόβλημα υψηλών τιμών του NMN , στην προηγούμενη εργασία μας προτείνουμε μια μέθοδο καθαρισμού από βακτηριακά κύτταρα. Για περαιτέρω βελτιστοποίηση της διαδικασίας, καθώς μπορέσαμε να βρούμε μόνο μία μέθοδο παραγωγής ζυμομύκητα, αυτή η μελέτη προτείνει μία απλή και οικονομικά αποδοτική μέθοδο βιοτεχνολογικής παραγωγής NMN στο Escherichia coli .

Αποτελέσματα

Βακτηριακός μετασχηματισμός

Η ευθυγράμμιση των αλληλουχιών πολλαπλών αμινοξέων που παράγονται για υποθετικά NadV από Haemophilus ducreyi , NadV, Shewanella oneidensis MR-1 και Nampt από Mus musculus , παρουσιάζει μεγάλη ομοιότητα (Σχήμα S1), καθιστώντας όλα αυτά τα ένζυμα υποψήφια για μια βιοτεχνολογική διαδικασία.

Μετασχηματισμένος Ε . κυττάρων coli με γονίδια nadV (NAMPT) που φέρονται από pET28a (+) πλασμίδια σχημάτισαν αποικίες στις πλάκες LB Agar συμπληρωμένες με καναμυκίνη. Δεν ανιχνεύθηκαν αποικίες σε πλάκες εμβολιασμένες με μη μετασχηματισμένα βακτηριακά κύτταρα. Η ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης του πλασμιδικού ϋΝΑ που απομονώθηκε από αυτές τις αποικίες επιβεβαίωσε την παρουσία πλασμιδίων Nampt-ΡΕΤ28α, ρΕΤ28α-οΝΑΝνν ή pET28a-hdNadV σε Ε . coli DH5a (Συμπληρωματικό Σχήμα S2A, λωρίδα 2, 3, 4). Οι ζώνες DNA ταιριάζουν με τις ζώνες από την Ε . coli BL21 (DE3) pLysS (Συμπληρωματικό Σχήμα S2A, λωρίδα 6, 7, 8), τα οποία μετασχηματίστηκαν με αντίστοιχα πλασμίδια που εκχυλίστηκαν απευθείας από την Ε . coli DH5a. Στο μη μετασχηματισμένο Ε . coli BL21 (DE3) pLysS, που χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος, επιβεβαιώθηκε η παρουσία του πλασμιδίου pLysS με ηλεκτροφόρηση, μια ταινία που ταιριάζει με το γνωστό μήκος 4886 bp (Συμπληρωματικό Σχήμα S2A, λωρίδα 5) παρουσιάστηκε σε πήκτωμα αγαρόζης.

(Για περισσότερα πειραματικά δεδομένα, ανατρέξτε στον αρχικό ιστότοπο: https://www.nature.com/articles/s41598-018-30792-0#Sec14)