LRRK2-IN-1 CAS 1234480-84-2 Βιολογική Δραστηριότητα

In Vitro   

Η μεταγωγή άγριου τύπου και G2019S έχει ως αποτέλεσμα 2,5 φορές υψηλότερο σήμα TR-FRET, το οποίο μπορεί ναLRRK2-ΣΕ-1δοσοεξαρτώμενος με τιμές IC50 0,08 μM και 0,03 μM, αντίστοιχα[1]. Το LRRK2-IN-1 κατείχε IC50 45 nM για αναστολή του DCLK2 και παρουσιάζει IC50 μεγαλύτερη από 1 μM όταν αξιολογήθηκε σε βιοχημικές δοκιμασίες για AURKB, CHEK2, MKNK2, MYLK, NUAK1 και PLK1. Το LRRK2-IN-1 έχει επιβεβαιωθεί ότι αναστέλλει το MAPK7 με EC50 160 nM. Το LRRK2-IN-1 προκαλεί δοσοεξαρτώμενη αναστολή της φωσφορυλίωσης Ser910 και Ser935 συνοδευόμενη από απώλεια 14-3-3 που συνδέεται τόσο με τον άγριο τύπο LRRK2 όσο και με το LRRK2[G2019S] που μεταφράζεται σταθερά στα κύτταρα HEK293[2]. Το LRRK2-IN-1 είναι μέτρια κυτταροτοξικό με IC50 των 49,3 μM σε κύτταρα HepG2. Το LRRK2-IN-1 παρουσιάζει γονοτοξικότητα παρουσίας και απουσίας του S9 στα 15,6 και 3,9 μM, αντίστοιχα[3]. Το LRRK2-IN-1 αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και προκαλεί κυτταρικό θάνατο με χαρακτηριστικά της απόπτωσης των κυττάρων HCT116 και AsPC-1[4]..

In Vivo    

Το LRRK2-IN-1 (100 mg/kg, i.p.) προκαλεί αποφωσφορίωση του LRRK2 στο νεφρό των ποντικών[2]. Περιτουμπορική ένεση του LRRK2-IN-1 (100 mg/kg) οδηγεί σε σημαντική μείωση του όγκου του όγκου του όγκου και του βάρους των ξενομοσχευμάτων όγκου AsPC-1[4].

Δοκιμασία κινάσης 

Ενεργό GST-LRRK2 (1326-2527), GST-LRRK2 [G2019S] (1326-2527), GST-LRRK2 [A2016T] (1326-2527) και Το ένζυμο GST-LRRK2 [A2016T+G2019S] (1326-2527) καθαρίζεται με σπηλαιόζη γλουταθειόνης από εξαισθητικά κυττάρων HEK293 36 h μετά από παροδική μόλυνση των κατάλληλων κατασκευών cDNA. Οι δοκιμασίες πεπτιδικής κινάσης, που πραγματοποιούνται εις διπλούν, δημιουργούνται σε συνολικό όγκο 40 μL που περιέχει 0,5 μg LRRK2 κινάσης (η οποία σε καθαρότητα περίπου 10% δίνει τελική συγκέντρωση 8 nM) σε 50 mM Tris/HCl, pH 7,5, 0,1 mM EGTA, 10 mM MgCl2, 20 μM Nictide, 0,1 μM [γ-32P]ATP (500 cpm/pmol) και οι υποδεικνυμένες συγκεντρώσεις αναστολέα διαλυμένων σε DMSO. Μετά από επώαση επί 15 λεπτά στους 30°C, οι αντιδράσεις τερματίζονται με τον εντοπισμό 35 μL του μίγματος αντίδρασης σε χαρτί φωσφοκυτταρίνης P81 και τη βύθιση σε φωσφορικό οξύ των 50 mM. Τα δείγματα πλένονται εκτενώς και η ενσωμάτωση της [γ-32P]ATP στο Nictide ποσοτικοποιείται με την καταμέτρηση του Cerenkov. Οι τιμές IC50 υπολογίζονται με το GraphPad Prism χρησιμοποιώντας μη γραμμική ανάλυση παλινδρόμησης.

Δοκιμή κυττάρων

Τα κύτταρα (104 κύτταρα ανά πηγάδι) σπέρνονται σε μια πλάκα καλλιέργειας ιστών 96-καλά σε τριπλό. Τα κύτταρα είναι καλλιεργημένα παρουσία του LRRK2-IN-1 με DMSO ως όχημα σε 0, 0,31, 0,63, 1, 2 και 5, 10, και 20 μM. 48 ώρες μετά την επεξεργασία, προστίθενται 10 μL αντιδραστηρίου TACS MTT σε κάθε πηγάδι και τα κύτταρα επωάζονται στους 37°C έως ότου το σκοτεινό κρυσταλλικό ίζημα γίνει ορατό στα κύτταρα. Στη συνέχεια προστίθενται 100 μL 266 mM NH4OH σε DMSO και τοποθετούνται σε αναδευτήρα πλάκας σε χαμηλή ταχύτητα για 1 λεπτό. Μετά το κούνημα, η πλάκα αφήνεται να επωάσει για 10 λεπτά προστατευμένη από το φως και το OD550 για κάθε πηγάδι διαβάζεται χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη μικροπλακών. Τα αποτελέσματα υπολογίζονται κατά μέσο όρο και υπολογίζονται ως ποσοστό του ελέγχου DMSO (όχημα) +/- του τυπικού σφάλματος του μέσου όρου.

Διαχειριστής ζώων

LRRK2-ΣΕ-1διαλύεται σε Captisol και χορηγείται με ενδοπεριτοναϊκή ένεση σε αρσενικούς ποντικούς άγριου τύπου C57BL/6 σε δόση 100 mg/kg. Τα ποντίκια ελέγχου εγχέονται με ίσο όγκο Captisol. Στα χρονικά σημεία 1 και 2 ώρας, τα ποντίκια εξουδεύσουν από την αυχενική εξάρθρωση και ο ιστός των νεφρών και του εγκεφάλου διαμελίζεται γρήγορα και καταψύχεται σε υγρό άζωτο.

Αναφορές

[1]. Hermanson SB, et al. Διαλογή για τους νέους αναστολείς LRRK2 χρησιμοποιώντας μια υψηλής απόδοσης TR-FRET κυτταρική δοκιμασία για LRRK2 Ser935 Φωσφορυλίωση.PLoS Ένα. 2012;7(8):e43580. Epub 2012 Αυγ 28.

[2]. Deng, Xianming., et al. Χαρακτηρισμός ενός εκλεκτικού αναστολέα της κινάσης LRRK2 της νόσου του Πάρκινσον. Χημική Βιολογία της Φύσης (2011), 7(4), 203-205.

[3]. Koshibu K, et al. Εναλλακτική λύση στο LRRK2-IN-1 για φαρμακολογικές μελέτες της νόσου του Πάρκινσον. Φαρμακολογία. 2015;96(5-6):240-7.

[4]. Weygant N, et al. Μικρός αναστολέας κινάσης μορίων LRRK2-IN-1 επιδεικνύει την ισχυρή δραστηριότητα ενάντια στον καρκίνο του παχέος εντέρου και του παγκρέατος μέσω της αναστολής της διπλόκορτίνης-όπως κινάσης 1. Mol Καρκίνος. 2014 Μάιος 6;13:103